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 Cultivo de Células-Tronco da MO (Medula Óssea)

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Hélia Cannizzaro



Mensagens : 1065
Data de inscrição : 23/06/2013

MensagemAssunto: Cultivo de Células-Tronco da MO (Medula Óssea)   Sex Ago 02, 2013 12:09 am

Turma 133
Interessante este tema. Cultivar células-tronco de MO (Medula Óssea) para tratamento.
Será que o cultivo de células mononucleares da MO (CMMO) seriam interessantes para serem transplantadas em pacientes com imunodeficiências, após análise de compatibilidade do doador (HLA)?
Vejam o Protocolo.

Células-Tronco Derivadas da MO (medula óssea)
Como todo tecido hematopoiético, a MO é constituída por células reticulares (jovens) associadas a fibras reticulares (também em grande quantidade nos tecidos linfóides), muitos capilares sinusóides, entre as células reticulares a presença de macrófagos, células adiposas, células precursoras de eritrócitos, granulócitos, monócitos, plaquetas e células-tronco indiferenciadas. Na população de células-tronco da MO encontramos as células-tronco hematopoiéticas (HSC) responsáveis pela produção de todas as células sanguíneas e as células-tronco mesenquimais (MSC) pela formação das células do estroma da MO (regulando a hematopoiese. O conceito de terapia celular começou com a utilização das HSC em transplantes de medula. Os estudos começaram com "proteção à irradiação" atribuído às células de MO transplantadas em camundongos pré-irradiados. Em 1963, Mathé et al (colaboradores) realizaram o primeiro transplante alogênico de medula em paciente com leucemia. Estudo do HLA (antígenos leucocitários humanos) elucidaram grande parte dos problemas de rejeição imunológica e em 1979 foi realizado o primeiro transplante de MO no Brasil. É tão importante o papel dos leucócitos na rejeição que no tratamento do sangue em transfusões sanguíneas se retira os leucócitos. As células da MO são as mais utilizadas nos modelos experimentais, pré-clínicos e clínicos com o objetivo de reparo e/ou regeneração de órgãos não hematopoiéticos como o coração, cérebro, fígado, pulmão entre outros. No adulto normal, produz por dia cerca de 2,5 bilhões de eritrócitos, 2,5 bilhões de plaquetas e 1,0 bilhão de granulócitos / Kg de peso corporal. Esta produção é ajustada frente às necessidades do organismo através de estímulos específicos às CFUs (Unidades Formadoras de Colônia). In vivo, as HSC são utilizadas no tratamento de leucemia e linfoma, desordens sanguíneas hereditárias, recuperação da medula pós-quimioterapia e síndromes de imunodeficiência, e em doenças não hematológicas. As células MSC têm aderência in vitro, facilitando seu cultivo em laboratório, e podem se diferenciar em osteócitos, adipócitos e condrócitos. As MSC expressam na superfície CD105 (endoglina), CD73 (ecto-5´nucleotidase) e CD90 (Thy-1) - e não expressam o fenótipo de HSC como CD45 (antígeno comum dos leucócitos - LCA), CD34, CD14 (expresso também em macrófagos) ou CD11b (integrina α M), CD79 (IgA) ou CD19 (B4) e HLA classe II (MHC classe II). O problema do uso de MSC é que elas têm uma baixa expansibilidade.
Obtenção de Linhagens Celulares Específicas -
O aspirado medular humano pode ser obtido através da punção da crista ilíaca após o doador receber anestesia local (prévia análise de compatibilidade HLA).
Exemplo de obtenção de células mononucleares da MO (CMMO) em Ficoll-Hypaque TM Plus (diferencial gradiente de sedimentação):
1. Diluir o aspirado medular em solução salina (NaCl 0,1%) na proporção de 1:1;
2. Filtrar por 2 vezes consecutivas em filtros em 200 e 100µm, respectivamente;
3. Colocar a solução filtrada sobre o Ficoll-PaqueTM PLUS, em temperatura ambiente, na proporção 1:1;
4. Centrifugar a 400 x g por 30 minutos a 25oC;
5. Retirar cuidadosamente com pipeta Pasteur a camada gordurosa que se forma na superfície após esta centrifugação e descartá-la, a fim de que esta não contamine o anel de CMMO;
6. Recolher lentamente os anéis de CMMO formados na interface Ficoll / medula e colocá-los em tubos separados;
7. lavar os anéis assim: completar o volume com salina (NaCl 0,1%) para aproximadamente 45ml e ressuspender as células (homogeinizar). Centrifugar a 273 x g por 15 minutos a 25oC. Após a centrifugação descartar o sobrenadante e ressuspender o precipitado de células no fundo (pellet de CMMO) em solução salina (NaCl 0,1%). Repetir este processo três vezes;
8. Após a última lavagem, ressuspender o precipitado de células (pellet) em um único tubo com 5ml de Nacl 0,1%;
9. Retirar uma amostra para contagem de células em hemocitômetro utilizando azul de tripan (para ver viabilidade celular) e líquido de Turk (para lisar as hemácias);
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